مقدمه

تب تیفوئید که بوسیله باکتری سالمونلا تیفی ایجاد می شود هنوز یکی از مهمترین بیماری های عفونی مطرح در دنیا می باشد. بر اساس تخمین های زده شده در هر سال 16 میلیون نفر به این بیماری مبتلا شده و باعث مرگ بیش از 600 هزار نفر می شود (1). در حال حاضر شناسایی این باکتری از طریق جداسازی آن از خون، مغز استخوان، مدفوع، ادرار و سایر مایعات بدن امکان پذیر می باشد. کشت خون مبتلایان به تب تیفوئید به تنهایی ممکن است بین45 تا 70 در صد مثبت گردد این درحالی است که حداقل بین 20 تا 30 میلی لیتر خون لازم است تا بتوان از آن جهت شناسایی استفاده نمود. تست کمکی این روش که در تشخیص می تواند کمک کننده باشد تست ویدال است. این روش نیز به دلیل آنکه بصورت غیر اختصاصی عمل می کند بصورت 100 درصد قابل اعتماد نمی باشد. روش های دیگر به دلایلی از جمله گرانی و زمان بر بودن کمتر مورد توجه می باشند (2). يكي از روشهاي شناسايي عوامل بيماريزا استفاده از تكنيك PCR مي‌باشد كه از سرعت و حساسيت بسيار بالايي برخوردار است. ردیف های خاصی از اسید نوکلئیک جهت شناسایی باکتری سالمونلا تیفی استفاده شده است. در مطالعه ای که توسط سلطانی در سال 2005 انجام گردید با استفاده از 3 جفت پرایمر نسبت به شناسایی این باکتری اقدام نموده و نشان داده شدکه روش multiplex PCR مورد استفاده می تواند تا 250 سلول مورد شناسایی قرار گیرد (3) محققین با استفاده از روش PCR توانسته اند تا 40 باکتری سالمونلا تیفی را در مواد غذایی شناسایی نماید (4) تمام سویه های سالمونلا تیفی که از خون جدا شده است دارای آنتی ژن Vi (که به ناحیه ViaB نامیده شده) بوده که این آنتی ژن به عنوان یک عامل حدت زا مطرح می باشد این آنتی ژن در تعدادی از سویه های دیگر از جمله سالمونلا پاراتیفی C، تعدادی از سویه های سالمونلا دوبلین گزارش شده است (5). در این تحقیق یک جفت پرایمر اختصاصی بر اساس ترادف ژن ViaB طراحی گردید تا بتوان با سرعت و اختصاصیت نسبت به شناسایی باکتری سالمونلا تیفی اقدام نمود.

مواد و روش ها

 

 

باكتري هاي مورد استفاده:

براي اين منظور باكتري‌هاي مورد آزمايش شامل

Salmonella typhimorium ATCC= 14028، نمونه کلینیکی Salmonella typhi،

Shigella flexneri، Staphylococcus aureus ATCC=25923، Escherichia coli،Bacillus subtilis، Clostridium botulinumو Salmonella typhi PTCC =1185 بود. در این تحقیق دو سوشی که قبلا از طریق روش های معمول آزمایشگاهی به عنوان Salmonella dublin، Salmonella paratyphi C شناسایی شده بودند نیز مورد بررسی قرار گرفت

 

 

انتخاب قطعات ژني و تهيه پرايمر‌هاي مناسب:

يك جفت پرايمر از ژن (جدول 1) viaBدر باكتري سالمونلا تيفي طراحي و سپس بوسيله نرم‌افزارهاي مولكولي BLASTو Oligo وجود لوپ، دماي ذوب و ساير خصوصيات پرايمر مورد بررسي قرار گرفت. پس از بررسي و تأئيد خصوصيات،جهت ساخت پرايمرها به شركت سیناژن سفارش داده شد.

 

جدول 1 خصوصیات پپرایمر طراحی شده

 

شناسایی باکتری سالمونلا تيفي به روش مولکولی PCR:

تخليص ژنوم: براي استخراج و تخليص DNA ژنوميك از روش CTAB استفاده شد. براي اين منظور5/1 ميلي ليتر از محيط كشت باكتري هاي مورد مطالعه به مدت 5ـ2 دقيقه در rpm6000-5000 سانتريفوژ شد و رسوب (Pellet) حاصل در 567 ميكروليتر بافر TE (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA)، 30 ميكروليتر بافر SDS 10% و3 ميكروليتر آنزيمProteinase K (20 mg/ml) حل و به مدت 3ـ1 ساعت در 37 درجه سانتي گراد نگهداري شد. به مخلوط حاصل 100 ميكروليتر نمك NaCl 5Mو 80 ميكروليتر محلول CTAB/NaCl (Cetyltrimethylammonium bromide) (1/4 گرم NaCl، 10 گرم CTAB و 80 ميلي ليتر DDW) اضافه و به مدت 15ـ10 دقيقه در 65 درجه سانتي گراد گرمادهي شد. سپس به مخلوط حاصل780 ميكروليتر مخلوط كلروفرم ـ ايزوآميل الكل (به نسبت 24 كلروفرم و 1 ايزوآميل الكل) اضافه و پس ازتكان دادن به مدت 25ـ20 دقيقه درrpm2500سانتريفوژ شد. محلول روئي به تيوب ديگري منتقل شده و هم حجم آن مخلوط فنل ـ كلروفرم ـ ايزوآميل الكل (25/24/1) اضافه شد و پس از سانتريفوژ25 ـ20 دقيقه اي در rpm 2500، عمل ترسيب DNA بوسيله ايزوپروپانول و اتانول (70%) در دماي 20- درجه سانتي گراد انجام گرفت ودر نهايت DNA حاصل در100-50 ميكروليتر بافر TE ( pH=8) و 5-3 ميكروليتر آنزيم Rnase A حل شد.

واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR): براي انجام فرايند PCR ، 2 ميكروليتر از DNA تخليص شده ( با غلظت ng/µl200) از باكتري سالمونلا تیفی با 23 ميكروليتر از ديگر اجزا واكنش PCR مخلوط شد. اين اجزا عبارتند از 1 ميكروليتر از هر يك از پرايمرها باغلظت pmol/µl20 (در مجموع 2 ميكروليتر)، 2 ميكروليتر از مخلوط dNTP باغلظت mM5/2، 25/1ميكروليترMgCl₂ باغلظت mM50، 5/2 ميكروليتر 10 PCR buffer X، 15 ميكروليتر آب مقطراستريل(DDW) و 25/0 ميكروليتر آنزيم Taq DNA polymerase (5 unit/µl) بود. برنامه PCR شامل يك مرحله واسرشت در 94 درجه سانتي گراد به مدت 5 دقيقه، 30چرخه تكثيرDNA (94 درجه سانتي گراد 30 ثانیه، 59 درجه سانتي گراد 30 ثانیه، 72 درجه سانتي گراد 45 ثانیه) و يك مرحله نهايي در 72 درجه سانتي گراد به مدت 5 دقيقه بود. پس از انجام واكنش 5 ميكرو ليتر از محصولات واكنش به همراه يك ميكروليتر محلول رنگ زا (Loading buffer) توسط ژل آگارز 2% به مدت 20 دقيقه تحت تاثير ولتاژ 100 الكتروفورز شد. سپس محصولات PCR بوسيله دستگاه ژل داک مورد بررسي قرار گرفت

تاييد محصولات واكنش: براي اين منظور از هضم آنزيمي محصولات واكنش توسط آنزيم هاي محدود كننده استفاده شد. پس از بررسي توالي مورد انتظار توسط نرم افزار DNASIS ، آنزيم Taq1براي هضم قطعه مورد نظرانتخاب گردید. پس از تكثير هر يك از قطعات به صورت مجزا، 8 ميكروليتر از آن ها توسط 2 ميكروليتر از آنزيم مربوطه به مدت 4 ساعت در 65 درجه سانتي گراد مورد هضم قرار گرفت و محصول هضم آنزيمي بر روی ژل آگارز1% الكتروفورز شد.

تعيين ميزان اختصاصي بودن واكنش PCR: براي اين منظور، واكنش PCR با ژنوم تخليص شده از 8 باكتري انجام شد و محصول واكنش بر روی ژل آگارز 2% الكتروفورز شد.

تعيين ميزان حساسيت واكنش PCR:

براي محاسبه حساسيت واكنش بر اساس تعداد باكتري، پس از كشت باكتري در محيط BHI و اندازه گيري OD محيط كشت، ابتدا از محيط مورد نظر تا ^8-10 رقت تهيه كرده و براي تمامي رقت ها واكنش PCR انجام شد و جهت محاسبه تعداد باكتري در هر رقت فرآيند شمارش باكتري انجام گردید.

نتايج

سويه های مورد استفاده بوسيله روش هاي استاندارد آزمايشگاهي شناسايي شدند. پرايمرها و قطعات انتخاب شده جهت PCR توسط نرم افزارهاي مولكولي مورد بررسي قرار گرفتند و یک جفت پرايمر جهت تكثير قطعه مورد نظر طراحي شده و كيفيت آنها در الكتروفورز با ژل پلي اكريل آميد بررسي و تاييد گرديد. برای جستجوی سالمونلا تیفی واکنش PCR با یک جفت پرایمر ویژه ژن viaB انجام شد که مشاهده قطعه 530 جفت باز مربوط به بخشی از ژن viaBنشان دهنده وجود این ژن در باکتری سالمونلا تیفی بود (شکل 1 ستون 1)

تاييد محصولات PCR: پس از بررسي قطعات تكثير شده توسط نرم افزار DNASIS ، Taq1براي هضم اين قطعات در نظر گرفته شد كه پس از انجام هضم آنزيمي برروي این قطعه نتیجه حاصل از آن در شكل 1، ستون 2 مشاهده مي شود.همانگونه كه انتظار می رفت آنزيم Taq1 قطعه viaB را در جايگاه 306 مورد برش قرار داده كه در نتيجه اين فرايند دو قطعه 224 و306 جفت باز ايجاد گردید (شکل 1، ستون 2).

ميزان اختصاصي بودن واكنش PCR: پس از انجام واكنش PCR با 6 باكتري و الكتروفورز محصولات PCR، نتيجه حاصل از آن در شكل 2 مشاهده مي شود. در این آزمایش قطعه مورد نظر تنها در سالمونلا تيفي تكثير یافته (شکل 2 ستون 2)و در مورد 5 باكتري‌ديگر اين قطعه تكثير نشده است (شکل 2 ستون 3 تا 7). در این تحقیق دو نمونه کلینیکی که توسط روش های معمول در آزمایشگاه به عنوان سالمونلا دوبلين و سالمونلا پاراتيفي C معرفی شده بودند با استفاده از پرایمرهای طراحی شده مورد بررسی قرار گرفت (شکل 3 ستون 9 و ستون 10) و مشخص گردید که قطعه530 جفت باز در این دو باکتری وجود دارد. از آنجايي كه در بررسي جفت پرايمر مورد نظر بوسيله نرم‌افزارهاي مولكولي، هيچ باكتري به غير از سالمونلا تيفي شناسایی نگردید، نسبت به برش محصول واكنش PCR با ژنوم دو باکتری توسط آنزيم‌محدود كننده TaqI اقدام شد و در نتيجه اين فرايند دو قطعه 224 و306 جفت باز ايجاد گردید که نشان دهنده تشخیص اشتباه در آزمایشگاه بود و هر دو سویه سالمونلا تیفی می باشد. با انجام تست هاي بيوشيميايي مجدد نتیجه بدست آمده توسط روش PCR مورد تایید قرار گرفت .

ميزان حساسيت واكنش PCR:

پس از تهیه سریال رقت نسبت به میزان حساسیت واکنش اقدام گردید. همانگونه كه در شکل 4 مشاهده مي‌شود تكثير قطعه مورد نظر توسط واكنش PCR تا رقت ^4-10 از محيط كشت باكتري انجام شده است كه در اين رقت تعداد باكتري برابر cfu/µl50 مي‌باشد، كه نشان دهنده حساسيت واكنش بر حسب تعداد باكتري است.

بحث

سالمونلا انتریکا سروتیپ تیفی عامل تب تیفوئید بوده و به عنوان اصلی ترین عامل بیماری زای انسان در بین انواع سالمونلا ها شناخته شده است. سالانه 16 میلیون مورد از بیماری ايجاد شده توسط این باکتری در دنیا گزارش شده که سبب 600 هزار مورد مرگ می شود[4،2]. با توجه به کثرت مبتلایان به این بیماری که 5 تا 10 درصد بيماران بستري در بيمارستان هارا تشکیل می دهند[3]. تلاش شده است تا از انواع مختلفی از آنتی بیوتیک ها برای مقابله با این باکتری استفاده نمایند هر چند با افزایش تعداد باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک، مشکلات درمانی روز به روز پیچیده تر می شود لذا شناسايي سريع و قطعي باكتري عامل حصبه اهميت بسياري داشته و دلیل آن از بين رفتن سريع پاتوژن و دفع بيماري در مراحل اوليه می باشد.

جهت تشخيص آزمايشگاهي باكتري سالمونلا تيفي در نمونه هاي كلينيكي از روش هاي مختلفی استفاده شده است كه شامل كشت خون، كشت مغز استخوان، كشت روده، كشت ادرار، كشت دانه هاي قرمز، كشت اثني عشر، تست ويدال، اليزا و ايمونوفلورسنس مي باشند.

تست ويدال و كشت خون به عنوان روش هاي تشخيصي رايج باقي مانده اند و ساير روش ها به دلايلي از جمله اشتباه در تشخيص و هزينه بالا كم تر مورد استفاده قرار می گیرند[6].

تست ويدال براي تشخيص سريع اين بيماري روش مناسبي نمي باشد زيرا اين تست ، براساس وجود آنتي بادي هاي ضد سالمونلا، پي ريزي شده است و از آنجا که آنتي بادي هاي مشابهي در ميان ارگانيسم هاي جنس سالمونلا و برخي از ارگانيسم هاي ديگر وجود دارد می تواند منجر به واکنش متقاطع بین آنها گردد.

از آنجا که روش هاي متداول تشخيص سالمونلا تيفي نيازمند زمان طولاني بوده و فاقد كارايي لازم جهت تشخيص سريع و دقيق اين باكتري مي باشند. در اين تحقيق از روش PCR جهت تشخيص عامل حصبه و تفكيك آن از ساير باكتري ها استفاده شده است.

در سال 1993 ميلادي سونگ و همكارانش توانستند سالمونلا تيفي را توسط ژن flagellin شناسايي نمايند[7]. در سال 1998 ميلادي تركوو و همكارانش از ژن16S rRNA و نيز در سال 2003 ميلادي پاتماناتان و همكارانش از ژن hilA جهت شناسايي جنس سالمونلا استفاده نمودند[8،9]. در اين دو روش، گونه سالمونلا قابل شناسايي نبود و با توجه به آنكه همه جنس هاي سالمونلا براي انسان خطرناك نمي باشند، روش هاي فوق كارايي لازم براي استفاده در آزمايشگاه هاي را كلينيكي ندارند.

محققين جهت تشخيص مولكولي سالمونلا تيفي پرايمرهاي مختلفي را بر اساس رديف ژن هاي شناخته شده tyv ,prt ,flic-d و flic-a طراحي و بررسي نموده اند[10]. در تحقيق ديگري در سال 2005 ميلادي از ژن هاي,tyv ,prt invAجهت تشخيص مولكولي سالمونلا تيفي استفاده گرديد. در اين گزارشات تعداد پرايمرهاي استفاده شده زياد بوده است[11].

در اين بررسي، نمونه ژنوم باكتري هاي استاندارد و كلينيكي سالمونلا تيفي، سالمونلا تيفي موريوم همراه با گونه هاي ديگر شامل: شيگلا، اشريشياكلي، استافيلوكوكوس اورئوس، باسيلوس ساب تيليس و كلستريديوم بوتولينوم با يك جفت پرايمر مورد بررسي قرار گرفت. نتايج اين بررسي ها مشخص نمود كه پرايمر انتخاب شده به طور اختصاصي قادر به تشخيص عامل سالمونلا تيفي مي باشد.

اين روش شناسايي بر اساس توالي نوكلئوتيدي مي باشد كه در ناحيه viaB قرار دارد بنابراين بستگي به حضور يا عدم حضور آنتي ژن Vi ندارد. در حقيقت سوش هاي سالمونلا تيفي Vi منفي نيز دارای اين ناحيه بوده و توسط اين جفت پرايمر قابل شناسايي مي باشند[11،12]. موشیموتو و همکارانش با استفاده از ترادف ژن ViaB نسبت به شناسایی باکتری سالمونلا تیفی اقدام نمود. ترادف انتخاب شده با سالمونلا پاراتیفی C واکنش داده و نتیجه PCR آن مثبت بوده است (5) در این تحقیق ترادفی انتخاب شد که پس از جستجو در بانکهای ژنی مشاهده گردید که هیچ واکنشی با سویه های دیگر سالمونلا ندارد.

با بررسي حساسيت این روش مشخص گردید كه در حدود c.f.u 50 از باكتري در نمونه قابل تشخيص می باشد. در بررسي هايي كه توسط سونگ و پاتماناتان انجام شد، ميزان حساسيت به ترتيب 1 تا 10 و c.f.u 1200 از باكتري گزارش شد[7،9]. با توجه به آنكه دوز عفوني باكتري سالمونلا تيفي در انسان 100 هزار باكتري مي‌باشد، در نتيجه از اين روش مي‌توان قبل از ايجاد بيماري نسبت به شناسايي اين باكتري اقدام نمود.

تشکر و قدردانی: بدینوسیله از دکتر میرزا خلیل بهمنی به دلیل مشاوره در انجام این تحقیق تشکر می گردد. 

منابع

1- Ivanoff B. Levine MM. Lambert PH. Vaccination against typhoid fever, Present status. Bull WHO 1994; 72: 957-971

 

2- Haque A. Ahmed J. Qureshi A. Early detection of typhoid by polymerase chain reaction. Ann. Saudi Med.1999; 19 (4): 337-340.

 

3- Soltani Banavandi MJ. Shahhosseiny MH. Shahbazzadeh D. Karimi V. Mirzahoseini H. Mahboudi M. Abachi M. Javadi G. Selective amplification of prt, tyv and invA genes by multiplex PCR for rapid detection ofSalmonella typh. Iranian Biomedical Journal 2005; 9 (3): 135-138.

 

4- Zhu Q. Lim CK. Chan YN. Detection of Salmonella typhi by polymerase chain reaction. J Appl Bacteriol. 1996; 80(3):244-51.

 

5- Hashimoto Y. Itho Y. Fujinaga Y. Khan Aq. Sultana F. Miyake M. Hirose K. Yamamoto H. Ezaki T. Development of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella typhi. J Clinical Microbiology. 1995; 775–777

 

6-Abdul H. Janbaz, A. Javed A. Early detection of typhoid by polymerase chain reaction. Ann Saudi Med1999; 19(4):337-340.

 

7- Song J. Cho H. Park M. Sun Na D. Moon H. Chik Pat H. Detection of Salmonella typhi in the blood of patients with typhoid fever by polymerase chain reaction. J CLINICAL MICROBIOLOGY. 1993; 1439-1443

 

8-Trkov M. Avgustin G. Spesific detection of Salmonella spp. with molecular biological techniques. Animal Microbiology. 1998; 29.

 

9- Pathmanathan SG. Cardona-Castro N. Sánchez-Jiménez MM. Correa-Ochoa MM. Puthucheary SD. Thong KL. Simple and rapid detection of Salmonella strains by direct PCR amplification of the hilA gene. J Med Microbiol. 2003; 773-776

 

10- Riyaz-hassan S. Verma V. Qazi GN. Rapid detection of salmonella by polymerase chain reaction. Mol cell probes 2004; 18:333-339

 

11- Looney RJ. Steigbigel RT. Role of the Vi antigen of Salmonella typhi in resistance to host defense in vitro. J. Lab. Clin. Med. 1986; 108:506-516.

 

12- French GL. King SD. Louis P. Salmonella serotypes, Salmonella typhi phage types, and anti-microbial resistance at the University Hospital of the West Indies, Jamaica. J. Hyg. Camb. 1977; 79:5–16.

 

 

شكل 1: برش آنزيمي محصول PCR:

ستون 1: ماركر (DNA Ladder Mix SM0333)

ستون 2: محصول PCR،

ستون 3: قطعات حاصل از برش آنزيمي

 

 

 

 

شكل 2: تعيين ميزان اختصاصي بودن واكنش PCR.

ستون 1: ماركر 100 جفت باز

ستون 2: سالمونلا تيفي PTCC=1185

ستون 3:شيگلا فلکسنری

ستون 4:اشريشياكلي

ستون 5:استافيلوكوكوس اورئوس 25923 ATCC=

ستون 6: باسيلوس ساب تيليس

ستون 7: كلستريديوم بوتولينوم

 

 

 

 

 

 

شكل3: تعيين ميزان اختصاصي بودن واكنش PCR با ديگر سويه هاي سالمونلا

 

 

ستون 1: ماركر 100 جفت باز

ستون 2، 3، 4، 5: نمونه هاي كلينيكي سالمونلا تيفي

ستون 6: سالمونلا تيفي موريوم ATCC=14028

ستون 7: نمونه كلينيكي سالمونلا تيفي موريوم

ستون 8: نمونه كلينيكي سالمونلا تيفي موريوم

ستون 9: نمونه كلينيكي مشکوک به سالمونلا دوبلين

ستون 10: نمونه كلينيكي مشکوک به سالمونلا پاراتيفي C

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: تعیین حساسیت بر حسب

نظرات شما عزیزان: