باسيل گرم مثبت درشت اسپوردار بي هوازي اجباري مي باشند . اسپور دراين جنس معمولا انتهايي يانزديك به انتها مي باشد . اغلب متحرك ئداراي فلاژل ازنوع پري تريش مي باشند . تستهاي كاتالاز واكسيداز منفي مي باشد .
كلستريديوم بوتولينوم C.botulinum
عامل بوتوليسم (مسموميت غذايي شديد وكشنده ) باسيل درشتي است كه اسپور آن بيضي شكل ونزديك به انتها قرار دارد . اين باكتري بي هوازي مطلق ومتحرك است .
براي جداسازي باكتريهاي كه اسپوردارند ازروش جداسازي به كمك حرارت استفاده كرد . براي اين منظور بايد نمونه مورد ازمايش رادرسرم فيزيولوژي سوسپانسيون شده وبه مدت 10 دقيقه جوشانده شود تاساير باكتريهاي بدون اسپور ازبين برود ( شوك حرارتي) سپس نمونه رادرشرايط مناسب (بي هوازي براي كلستريديومها) كشت داده وكلنيهاي ارگانيسم راشناسايي كنيد .
از محيطهاي انتخابي EYA (Egg-Yolk agar) و( CBI ( C.botulinum Isolation براي ايزوله كردن كلستريديومبوتولينوم استفاده مي شود .
نكته : براي شناسايي توكسين بوتوليسم ازتست الايزا وراديوايمونواسي وهماگلوتيناسيون پاسيو استفاده كرد .
كلسترديوم تتاني : C. tetani
كلسترديوم تتاني ياباسيل نيكولاير عامل بيماري كزاز مي باشد . اين باكتري بي هوازي اجباري است وداراي اسپورانتهايي بزرگي است كه ظاهري شبيه چوب طبل براي باكتري ايجاد مي كند . اين باكتري متحرك وفلاژل آن ازنوع پري تريش مي باشد . قند هاراتخمير نمي كند وكاتالاز منفي است .
تشخيص آزمايشگاهي :
1 - كشت : از محيط تيو گليكولات غني شده ، (Cooked Meat Broth ) CMB و آگار خوندار مي توان جهت كشت استفاده كرد . براي كشت پليت ها بايد به مدت 48 ساعت درشرايط بي هوازي ( ./.80 درصد نيتروژن ، 10درصد گازكربونيك .10 درصد هيدروژن ) در37 درجه سانتيگراد قرار گيرد .
كلستريديوم تتاني درسطح آگار خوندار ايجاد هموليز وسوارمينگ مي كند
2 - تست آگلوتيناسيون : كلني خالص ارگانيسم مورد نظر راباآنتي سرم پلي والان كلستريديوم تتاني مجاور مي كنيم كه درصورت توليد آگلوتيناسيون حضو ركلستريديوم تتاني اثبات مي شود .
كلستريديوم پرفرنژنس C. perfringens
پرفرنژنس يا باسيل ولشاي عامل اصلي بيماري گانگرن گازي است . اين باكتري بدون حركت وداراي يك اسپور بيضي شكل مركزي يانزديك به انتهاست . وباعث تورم سلول نمي شود . تاكنون 6 گروه آنتي ژني ازكلستريديوم شناسايي شده كه باحروف A تاF نامگذاري شده كه گروهA وگاهي F براي انسان بيماريزايند اسپور اين باكتري در موادغذايي كه حرارت كافي به قسمتهاي مياني ودروني آن نمي رسد وپس پخته شدن مدتي گرم نگهداري مي شوند باقي مانده وچنانچه شرايط وزمان رشد مناسب باشد مي تواند باعث مسموميت شود
تشخيص آزمايشگاهي :
1 - بررسي ميكروسكوپي : پس ازرنگ آميزي گرم باسيل درشت گرم مثبت بادوانتهاي گرد ، شبيه واگن قطار وبه صورت موازي مشاهده مي شود داراي يك اسپور بيضي شكل انتهايي يا نزديك به انتهاست .
2 - كشت : نمونه رادرآگار خوندار ، تيوگليكولات مي توان كشت داد . پس از 24 ساعت در شرايط هوازي مي توان بررسي كرد كه ’ا برروي آگار خوندار ايجاد هموليز دوگانه مي كند . هموليز بتا درداخل وهموليز آلفا درخارج ايجاد مي گردد . (از محيطهاي كشت اختصاصي نظير Lowbury و Lilly مي توان استفاده كرد .
نكته : كلستريديوم پرفرنژنس درمجاورت هوا زنده مي ماند ومي تواند رشد كند .
تستهاي تشخيصي :
1 - آزمون بررسي ترشح لسيتيناز :
ليسيتيناز باكتري قادر است كه لستين ( ماده طبيعي درزرده تخم مرغ ) رابه دي كيليسريدهاي نامحلول تبديل كند كه منجر به توليد هاله اي سفيد رنگ تامات دراطراف كلني درمحيط كشت حاوي لسيتين مي شود .
روش كار : يك كلني خالص رابرروي محيط كشت آگار زرده تخم مرغ (Egg Yolk Medium) منتقل كنيد سپس پليت رابه مدت 24 تا48 ساعت دردماي 36 درجه سانتيگراد قرار دهيد بعد از اين مدت پليت ها راازنظر كلنيهاي باهاله اي ازرسوب سفيد رنگ بررسي مي شود .
2 - تست نگلر (ممانعت از آلفا لسيتنيناز ) :
روش كار : ازپليت آگار خوندار با10 درصد زرده تخم مرغ (EYA) استفاده مي شود .به وسيله سواب كلني رادرسطح پليت كشت داده نيمي از سطح محيط كشت راباآنتي توكسين آلفا لسيتيناز بپوشانيد ودردماي 37 درجه سانتيگراد به مدت 24تا 48 ساعت نگهداري كنيد . درنيمه فاقد ضد سم اطراف پرگنه ها هاله كدري مشاهده مي شود ولي در نيمه ديگر هاله موجود نيست كه به علت آنتي توكسين مي باشد .
نكته : تست لسيتيناز دركلستريديوم باراتي ، كلستريديوم بايفر منتاس و كلستريديوم سوردلي نيز مثبت است به همين دليل تست لسيتيناز نمي تواند به تنهايي تائيد كننده قطعي پرفرنژنس باشد وبايد براي تشخيص قطعي ترشح الفا لسيتيناز توسط تست نگلر يررسي شود .
3 - تخمير طوفاني شير : stormy clot
روش كار : مقداري از كلني پرفرنژنس رادرلوله آزمايش حاوي شير تلقيح كرده وسپس به مدت 24 ساعت دردماي 37 درجه سانتيگراد درشرايط بي هواز ي قرار دهيد (ريختن پارافين روي لوله) .شير همراه باتوليد گازوتغيير شكلي بانماي طوفاني منعقد مي شود .
4- تخمير قندها :مقداري از كلني رادر لوله هاي محتوي محيط پايه فنل رد كه به طور جداگانه 1 درصد ازقندهاي گلوكز، ساكاروز، سالي سين، لاكتوز، مانيتول ومالتوز مي باشند بيفزاييد ، سپس آنها رابه مدت24 ساعت درجار بي هوازي در37 درجه قرار دهيد .
مالتوز +
مانيتول -
سالي سين متغيير
لاكتوز +
ساكاروز +
گلوكز +
نكته : كلستريديوم پرفرنژنس داراي Reverse Camp مثبت است ودرشرايط آزمايشگاهي اسپور توليد نمي كند .
نكته : درتست نگلر آنتي توكسين TYPA پرفرنژنس مورد استفاده قرار مي گيرد .
نكته : سميت توكسين بوتولينوم دربين كلستريديوم تتاني ، كورينه باكتريوم ديفتريه ويرسينيا پستيس از همه قوي تر است .
روش آزمايشگاهي درمواد غذايي : 10گرم ازماده غذايي مشكوك راتوزين كرده وسپس 10 ميلي ليتر محلول بافر فسفات به آن بيفزاييد ودر هاون چيني سترون كاملا يكنواخت كنيد . انگاه دوبطري درپيچ دار محتوي محيط گوشت پخته را انتخاب وآنها رابه مدت 5 دقيقه بادرشل جهت تخليه حبابهاي اكسيژن درحمام آب 80 درجه سانتيگراد قرار دهيد وبعد از خارج كردن ازحمام وكمي سرد شدنبه هريك ازلوله ها 2 الي 3 ميلي ليتراز سوسپانسيون آماده شده نمونه غذايي بيفزاييد ويكي ازدولوله راعلامت گذاري كنيدولوله علامت گذاري شده رابه مدت 10 دقيقه در65 درجه سانتيگراد قرار دهيد سپس2 تا4 ميلي ليتر ازمخلوط وازپار سترون (مخلوط مساوي از وازلين وپارافين )راكه ذوب شده به آهستگي ازكنارلوله طوري بريزيد كه سطح محيط راكاملا فرابگيرد وبعد هردولوله رابه مدت 48 ساعت درگرمخانه 37 درجه سانتيگراد قراردادهوس1س لوله هارابررسي كنيد. درصورت رشد باكتري بخش مايع داخل لوله كدر مي شود .
ويژگي هاي پرگنه هاي كلستريديوم پرفرنژنس :
1- درمحيط سولفيت پلي ميكسين سولفاديازين (SPS ) پرگنه ها بهدليل احياي سولفيت به رنگ سياه درمي آيند
.2-درمحيط آگارخوندار با نئومايسين پرگنه ها گرد، نامنظم، مسطح وشفاف بوده كه ممكن است به صورت هموليز باشد
شمارش :
ابتدا 10 گرم ازنمونه غذايي مشكوك رابااستفاده از محلول رينگر 1/4 رقتهاي اعشاري 10 (به توان 1- و2-و3-) تهيه كرده لوله رابه مدت 10 دقيقه درحمام آب 65 درجه قرار دهيد (شوك حرارتي )وپس از خارج كردن وسرد شدن در محيطهاي SPSو آگار خوندار با نئومايسين كشت دهيد .
شمارش درمحيط SPS
توسط پي پت سترون مقدار3 ميلي ليتر از هريك ازرقتهاي آماده شده رابرداشت كردهبه 3 پتري ديش خالي سترون اضافه كرده سپس حدود 15 تا20 ميلي ليتر از محيط sps كه ذوب شده وبه حرارت 45 تا 50 درجه رسيدهبه پتري ديش ها اضافه كردهپس از مخلوط كردن وسفت شدن دو پليت ازهر رقت رابه مدت 48 ساعت درجار بي هوازي وگرمخانه 37 درجه قرار داده وپليت سوم رابه عنوان شاهد درنظر مي گيريم . سپس پرگنه هاراشمارش نماييد .
ميانگين تعدادپرگنه هايي راكه دردوظرف پتري درشرايط بيهوازي رشد كرده اند بدست آورده سپس پرگنه هايي سياه رنگي راكه در روي پليت شاهد درشرايط هوازي رشد كرده اند راازآن كم كنيد . تعداد رادر رقت موردآزمايش ضرب كرده وبرحسب گرم ماده غذايي گزارش نماييد .
شمارش درمحيط آگارخوندار بانئومايسين
3 پتري ديش محتوي آگار خوندار انتخاب وبه سطح هريك از آنها مقدار 1/. ميلي ليتر ازمحلول يك درصد نئومايسين رابيفزاييد . پس ازخشك شدن سطح محيط به هريك از آنها يك دهم ميلي ليتر از رقتهاي موردنظر افزوده وتوسط ميله شيشه اي پخش كنيد . سپس دوظرف پتري رادرجار بي هوازي به مدت 48 ساعت در37 درجه سانتيگراد قرار دهيد پليت سوم رابه عنوان شاهد دردماي 37 درجه وشرايط هوازي قرار دهيد . سپس پليت ها راخارج كرده پرگنه ها راشمارش كرده وميانگين تعداد پرگنهايي كه دردو پليت ودر شرايط بي هوازي رشد كرده اند بدست آورده ، سپس تعداد پرگنهايي راكه روي پليت شاهد در شرايط هوازي رشد كرده اند از آن كم كنيد . تعداد رادر رقت مورد آزمايش ضرب كرده وبر حسب گرم ماده غذايي گزارش كنيد .
نظرات شما عزیزان:
تبادل
لینک هوشمند