آرتي-پيسي آر (RT-PCR)
اين روش به PCR نسخهبرداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن RNA است. اولين مرحله در اين روش تبديل RNA به DNA (DNAاي كه مكمل توايسهاي mRNA است) توسط آنزيم نسخهبردار معكوس صورت ميگيرد (RT). برخي از موجودات مانند برخي از ويروسهاي RNAدار، ژنومشان تنها از RNA ساخته شده است. بعضي از ويروسها مانند ويروس هپاتيت B هرگز به شكل DNA مابين در اثر آنزيم نسخهبردار معكوس درنميآيد. آنزيم نسخهبردار معكوس (RT) در اين روش از "Avian Myeloblastosis Virus (AMV)" و "Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV) " بهدست آمد.
كاربرد اين آنزيم بهدليل آنكه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام "ترموس ترموفيلوس" يك DNA پليمر از مقاوم به نام (Tth) بهبود يافت كه در حضور يون Mn+2 داراي فعاليت نسخهبرداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود و سپس Mn+2 اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي (EGTA) حذف ميشود و سپس اين آنزيم از DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير ميكند.
آرمز پيسيآر (ARMS-PCR)
اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهشهاي نقطهاي است. در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده ميشود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشاندهنده نبود جهش نقطهاي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشاندهنده حضور جهش نقطهاي در باز مورد نظر است. اين روش نامهاي ديگري نيز دارد از جمله MAMA-PCR مخفف Amplificatin Multation Assay Mismatch و COP-PCR مخفف Competitive Oligonucleotide Primming.
نستد پيسيآر (Nested-PCR)
در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده ميشود، طوري كه جفت دوم در بني جفت اول جاي ميگيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير ميشود، سپس محصول PCR حاصل به لولهاي ديگر منتقل ميشود و بهعنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم PCR انجام شده و ترادف كوچكتري از DNA كه درون PCR اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير ميشود.
مزاياي اين روش تغيير يافته PCR عبارت است از: 1) نياز به پروب (كاوشگر) و تأييدهاي بعدي كمتر است، 2) حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است و 3) به دليل انتقال محصول PCR دور اول به لوله جديد، ممانعت كنندهها رقيق ميشود. اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق توانستهاند بيماريهاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار جلوگيري كنند.
همچنين ويروس "سيتومگالوويدوس" كه ميتواند سبب ناشنوايي در 1% از كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق امكانپذير است. جنينهاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين روش تشخيص داده شدند.
Real-Time PCR
به علت ورود نسل جديدي از ترموسايكلرها با سيستم فلورومتري كه اجازه پايش پيوسته خاصيت فلوئورسانس محصول PCR در زمان جمع شدن را ميدهد، اين روش ابداع شد. در اين روش از كاوشگرها يا پروبهاي هيبريداسيون نشاندار شده با رنگهاي فلورسانس در انتهاي 5 يا 3 استفاده ميشود. كه امكان پايش پيوسته محصول PCR را بدون جداسازي آنها در روشهاي الكتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد ميدهد. اين سيستم در سال 1992 كشف شد. اين روش به دليل كاهش زمان سيلكهاي PCR، حذف مرحله Post-PCR و كاربرد نشانگرهاي فلوروژنيك و روشهاي حساس آشكارسازي تابش آنها باعث افزايش سرعت اين سيستم نسبت به سيستم PCR معمولي شده است. سازندگان و كاربران اين روش سعي ميكنند محصول PCR كوچكتر طراحي كنند تا سرعت افزايش يابد اما تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده PCR را بهينه نميكند. البته اين روش داراي معايبي نيز است از جمله ميتوان به عدم ناتواني در مشخص كردن اندازه محصول بدون باز كردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرمها با شيمي برخي رنگهاي فلورژنيك اشاره كرد. براي شناسايي بسياري از ويروسهاي عامل بيماريهاي انسان از اين روش استفاده شده است.
نظرات شما عزیزان: