نحوه رنگ آمیزی اسید فست یا ذیل نلسون
برای رنگ امیزی ذیل نلسون از سه محلول کربول فوشین،رنگ بر و رنگ زمینه استفاده می کنیم .
بعد از چیدن لامها (بعد از هموژناسیون) لامها را باید فیکس شوند. برای فیکس کردن دو روش تعریف شده است :
-
استفاده از حرارت
-
استفاده از فورر به مدت حداقل 10 دقیقه و در دمای 60 درجه سانتی گراد
بعد از فیکس کرد نمونه،روی لام را با رنگ کربول فوشین(فوشین بازی) آغشته می کنیم . بعد از پخش کردن رنگ کربول فوشین در سطح لام ، با استفاده از پنبه اغشته با الکل سطح زیری لام را حرارت میدهیم . نقطه بسیار مهم تاکید میکنیم نکته بسیار مهم در این قسمت این است که حرارت تا زمانی ادامه پیدا می کند که بخار از روی لام متصاعد شود. اگر مدت زمان بیشتری را برای حرارت در نظر بگیریم (برای مثال : برخی از منابع مهم خارجی اینمدت را 5 دقیقه هم گزارش کرده اند که با توجه به تحقیقات و مشاهدات مستقیم مرکز سل و ریوی تبریز و سایر مراکز کاملا اشتباه است ) باعث رسوب در سطح لام خواهیم بود که نتایج مثبت کاذب را افزایش می دهید . بعد از حرارت لام را به مدت 5دقیقه در هوای آاد قرار میدهیم در این مرحله تمام آرتیفکتها ، باسیلها و سایر مواد موجود در لام رنگ امیزی می شوند . شاید بپرسید علت حرارت در رنگ امیزی ذیل نلسون چیست ؟ از انجا که دیواره TB بسیار لیپیدی است بنابراین رنگ نمیتواند وارد دیواره باسیل شود بنابراین با حرارت نفوذ رنگ به داخل باسیل ها را افزایش می دهیم . بعد از 5دقیقه ، با آب معمولی لام را شستشو و آب گیری می کنیم (مستقیم به سطح لام آب نگیرید واز بغل لام آب دهی کنید.) و سپس با اسید الکل 3% رنگ بری را انجام می دهیم . اسید الکل به مدت 3 تا 4 دقیقه بر روی لام پخش شده و در این مرحله تمام رنگ ها از اجسام موجود در لام برداشته می شود ولی رنگ باسیلها به علت دیواره مخصوص انها شستشو داده نشده و رنگ قرمر کربول فوشین را در خود می گیرد . بعد از این مرحله در اتمام برای افزایش کنتراست از یک رنگ زمینه ای مانند متیلین بلو و یا مالاشیت سبز استفاده می کنیم . مدت زمان لازم برای متیلین بلو 1 دقیقه است . در مرحله آخر هم لام را خشک کرده و در زیر میکروسکوپ با عدسی 100 بررسی می کنیم .
چند نکته:
-
رنگ امیزی ذیل نلسون،متداولترین روش رنگ امیزی در آزمایشگاه های مایوباکتریولوژی است
-
هنگام رنگ امیزی انتقال لامها با پنس انجام شود .
-
در حرارت دادن رنگ کربول فوشین روی لام دقت شود که رنگ نجوشد و یا خشک نشود . خشک شدن رنگ موجب جدا شدن لام از گسترش می شود و جوشیدن ان احتمال بروز نتایج مثبت کاذب را افزایش می دهد .
-
اگر رنگ از روی لام پاک شود دوباره روی ان با رنگ پوشانیده شود .
-
بهتر است در شستشو پشت لام هم شستشو داده شود تا رنگ کربول فوشین پشت لام هم پاک شود .
-
در مرحله رنگ بری میتوان 3 یا 4 دقیقه در دو مرحله 1.5 یا 2 دقیقه ای انجام داد . یعنی دوباره رنگ بری کنیم .
-
بهتر است در اخر رنگ امیزی ذیل نلسون ، پشت لام را با الکل تمییز کنیم .
فرمول تهیه رنگ ذیل نلسون
1 ) محلول کربول فوشین - Carbolfuchsin
الف) محلول فوشين بازيك، 3/0 گرم از فوشين بازيك را در ml 10 اتانول 95 % حل مي كنند.
-
Basic fuchsin 0.3 g
-
Ethanol 95% 10 ml
ب) محلول فنل، مقدار 5 گرم از فنل كريستاله را كمي گرم مي كنند تا ذوب شود. سپس با اضافه كردن آب مقطر حجم نهايي آن را به 90 میلی لیتر مي رسانند.
-
Phenol crystals 5 g
-
Distilled water 90 ml
براي تهيه محلول كربول فوشين، مقدار ml 10 از محلول فوشين بازيك را به 90 میلی لیتر از محلول فنل اضافه مي نمايند.
۲ ) محلول رنگ بر
براي آماده كردن اسيد الكل ۳%، ml ۳ از اسيد كلريدريك غليظ را در ml ۹۷ از اتانول حل مي كنند.
-
Ethanol 96% 97 ml
-
HCl 3 ml
به آرامي اسيد را به ظرف الكل اضافه مي نمايند.
۳ ) محلول رنگ آميزي زمينه
۰.۳ گرم از آبي متيلن را در ۱۰۰ ml آب مقطر حل مي كنند.
-
Methylene blue 0.3 g
-
Distilled water 100 ml
براي تهيه رنگ زمينه، مي توان از سبز مالاشيت يا اسيد پيكريك استفاده كرد (مقدار محلول 5/2 گرم از سبز مالاشيت يا 5/3 گرم از اسيد پيكريك را در ml 500 آب مقطر حل مي كنند).
چند نکته :
-
بايد دقت نمود با گذشت زمان در محلول كربول فوشين، كريستال هاي كوچكي ايجاد مي شود كه ممكن است در رنگ آميزي اشكال ايجاد كند.
-
محلول ها براي مصرف يك ماه آماده کنید.
-
رنگها بايد در شیشه های قهوه اي رنگ نگهداري شوند.
نظرات شما عزیزان:
تبادل
لینک هوشمند