مسئله اصلی در بررسی یك ژن خاص مشكل هدف گیری آن در یك ژنوم پیچیده كه ممكن است بیش از صد هزار ژن داشته باشد است. بسیاری از روشها در ژنتیك ملكولی به این مشكل فائق‌آمده‌اند. تكنیكPCR در اواسط دههِ 1980 در دپارتمان ژنتیك انسانی بوسیلهِKaru Mullis ابداع‌و برای تكثیر ژن كم خونی داسی شكل و بتاگلوبین انسانی مورد استفاده قرار گرفتSaiki(1985) از پژوهشگران شركت مهندسی ستوساشكالات موجود را رفع كرد وروش متداول كنونی را ابداع نمود. حقوق تجاری این اختراع اینك به شركت هافمن - روچت تعلق داردKaru Mullis در سال 1993 موفق به كسب جایزهِ نوبل شیمی گردید. واكنش زنجیرهِ پلی مراز یك‌روش آزمایشگاهی است كه به منظور تولید انبوه قطعه خاص و انتخابی ازDNA به كار می‌رود.واكنش مبتنی بر تكثیر آنزیمی قطعه‌ای ازDNA است كه با استفاد از دو آغازگر چند نوكلئوتیدی كه مكمل پایانهِ َ5 هر دو رشته مورد نظر هستند، صورت میگیرد تا كپی شدن الگویDNA توسط آنزیم پلیمراز امكان‌پذیر شود در سال 1985 تنها سه مقاله علمی در زمینهPCR گزارش شده بود. پنج سال بعد از آن این روش در هزاران آزمایشگاه استفاده گردید و تاكنون هزاران‌مقاله و دهها كتاب مستقل به این موضوع اختصاص داده شده است به گونه‌ای كه دانشگاه آكسفوردحتی مجله‌ای به نامPCR منتشر می‌سازد .
به عقیده بیولوژیستهاPCRوسیله‌ای است كه سوزنی را در كوهی از كاه پیدا می‌كند.PCR از نظر اصولی عملی تشابه زیادی به همانند سازیDNA دارد و در واقع برگرفته از آن است‌بطوركلی دو فرق بینPCR و همانندسازی وجود دارد: همانند سازی در بدن در دمایc 37با آنزیمDNA پلی مراز و آنزیمهای دیگر صورت میگیرد درPCRبه علت نیاز به درجه حرارت بالا جهت‌واسرشت شدن از آنزیم مقاوم به حرارت همانندTaqاستفاده می‌شود و به جای سایر آنزیمها ازتغییرات درجه حرارت استفاده می‌شود.
مقایسه تكثیر ژن از طریق كلونینگ باPCR
- در كلونینگ هفته‌ها یا ماهها وقت برای تكثیر قطعهDNA لازم است، در حالیكه درPCR قطعات خاصDNA از ژنومی پیچیده، ظرف چند ساعت بدست می‌آید.
- درPCRمقادیر بسیار كمی ازDNAبرای تكثیر موردنیاز است درحالیكه در روشهای استاندارد كلونینگ وتجزیه وتحلیلهای بیولوژی ملكولی به چند میلیون قطعه ازDNAاحتیاج است.
- برای كلون كردن،DNAتا حد امكان باید خالص باشد ولی برایPCR خلوصDNAاهمیت زیادی ندارد
- تكثیرDNAدرPCRدر محیط عاری از سلول صورت میگیرد ولی كلونینگ به سلولهای زنده نیاز دارد.
- یكی از مزایایPCR سرعت آن است پلیمرازTaqمی‌تواند توالی‌هایی متجاوز از هزارجفت باز را در ظرف مدت كمتر از یك دقیقه تكثیر نماید.
- درPCRنیازی به جدا كردن قطعه مورد نظر از محل استقرارش در DNAنمی‌باشدحالیكه این محدودیت در روشهای كلونینگ وجود دارد.
اصول و مبانیPCR
واكنش زنجیره پلیمراز مبتنی بر تكثیر آنزیمی قطعه‌ای ازDNA است كه با استفاده ازآغازگر صورت میگیرد. طول آغازگر بایستی به اندازهِ كافی بزرگ باشد تا توالیهای مشابه به آنها درنواحی غیر هدف یافت نگردد پرایمرها دو عمل را انجام می‌دهند.اندازه قطعات تكثیر شونده را مشخص می‌كنند،محل ژنی كه باید تكثیر شود را مشخص می‌كنند.بعد از اتصال آغازگر به مكملهای خود در توالی هدف، انتهای هیدروكسیل َ3 آنها رو به سوی ناحیه هدف قرار میگیرد.
PCR طی سه دورهِ متوالی واسرشت سازیرشتهِ الگو، اتصال آغازگر و بسط توسط آنزیم پلیمراز انجام میگیرد.
در چرخه اول و دوم فرآوردهِ حاصل از بسط دارای طول مشخصی نیست. در چرخه سوم قطعاتی ساخته می‌شود كه طول آنها مشخص است از چرخهِ چهارم تكثیر به صورت نمائی است
پارامترهای سیكلی
روشPCR بطوردستی (بوسیله حمام آبی) و هم بطور اتوماتیك و با ترموسایكلر صورت میگیرد. ابتدا با حرارت 90-94(در30 ثانیه) دو رشتهDNA از یكدیگر جدا می‌شود و سپس بامختصری برودتc 30-65بمدت (30ثانیه) پرایمرها به مكملهای خود درروی رشتهDNA متصل‌می‌شوند وبه دنبال آن با رساندن دما به 57-70(5-2 دقیقه) شرایط برای گسترش پرایمرهای‌چسبیده بوسیلهِ آنزیم تك پلیمراز فراهم می‌شود.زمان شیب حرارتی یا زمانی كه درجه‌حرارت از مقداری به مقدار دیگر عوض می‌شود بستگی به نوع دستگاه به كار برده شده دارد برای‌اطمینان از اینكه نمونه‌ها به درجه حرارت مورد نظر رسیده‌اند مدت زمان پرش حرارتی بوسیلهِاندازه‌گیری ترمومتر نمونه درطی یك آزمایش تكثیرانجام می‌شود .گرمای غیركافی درطی‌مرحله واسرشت یكی ازعلتهائی است كه باعث شكست در واكنشPCR می‌گردد
استخراجDNA برایPCR
نقطهِ شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولكولی ضرورت جداسازیDNAبا كیفیت عالی است. معمولا كیفیتDNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی ازRNA، پروتئین، لیپید و سایرساختارهائی كه برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می‌كنند سنجیده می‌شود. به‌علت بزرگ بودن اندازهِDNAومی در پستانداران، روشهای استخراجDNA باید حداقل استرس‌مكانیكی را در طی استخراج ایجاد نمایند.معمولإ روشهائی كه در آنها چندین شوینده همچونSDS وtritonX100 استفاده می‌شود.
كه نقش آنها لیز نمودن سلول و كمك به از بین بردن پروتئین متصل بهDNA می‌باشد. پروتئین‌زدائی‌بیشتر از طریق پروتیئنازK صورت میگیرد كه این ماده در بافر لیز كننده مورد استفاده قرار میگیرد.این آنزیم در حضورSDSدر دمایc 56-65 فعالیت دارد تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت‌می‌شود برعكس در همین شرایط آنزیمهای دیگر مثلDNAase دناتوره می‌شود.متعاقب استفاده از پروتیئنازKاز ایزوپروپانول برای از بین بردن موِثر پروتئین‌ها استفاده می‌شود و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز بطور موِثر از طریق كاربرد فنل و كلروفورم از بین می‌رودآلودگیRNA از طریق تیمار كردن نمونه با RNAase از بین می‌رود.در روشهای دیگر بعد از پروتئینازK از نمك اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده می‌شود در استخراجDNA از هپارین برایPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارین از فعالیتTaq پلیمراز جلوگیری می‌كند .وجودEDTAحداقلmM 2در بافر استخراج باعث می‌شود كه كوانزیمهای آنزیمAase DNباEDTAشلات شود و از تجزیه تصادفیDNAجلوگیری نماید.
تعداد سیكلPCR :
بعضی از راهنمایی‌ها برای تعداد سیكلها در مقابل غلظت الگوی آغازی چنین پیشنهاد شدهاست.
طراحی آغازگر:
قواعد مشخصی برای اینكه بتوان با اطمینان یك جفت پرایمر موِثر را انتخاب كرد وجودندارد. در حال حاضر پرایمر بیش از هر عامل دیگری عامل موفقیت یا شكست در یك واكنش‌تكثیری است. بعضی قواعد راهنمایی‌های مفیدی را در مورد طراحی آغازگر می‌كنند كه ذیلاإ به آنهااشاره شده است.
- طول متوسط هر پرایمر بین 18- 30جفت باز پرایمر با طول كوچك اتصال غیراختصاصی را افزایش و پرایمر بزرگتر سرعت هیبریداسیون را كم می‌كند
مقدارG-C دو پرایمر با هم مشابه بوده و حدود 50-60 درصد باشد.
- آغازگرها را باید از نظر مكمل بودن با هم كنترل شوند.
پرایمر دایمر یا آغازگر دوتائی یك تكثیر مصنوعی است كه اغلب در محصولPCR مشاهده می‌شود و عبارتست از یك قطعهِ دو رشته‌ای كه طول آن تقریبا به مجموع دو پرایمر نزدیك است وهنگامی مشاهده می‌شود كه یك پرایمر توسط آنزیم پلیمراز به روی پرایمر دیگر گسترش یابدمكانیزم واقعی كه چگونه پرایمر دایمر تشكیل می‌شود بدرستی مشخص نیست. پرایمرها با انتهای‌مكمل َ3 مستعد تشكیل دایمر هستند. ضعف در آنزیمTaq باعث پلیمریزاسیون مستقیم الگوی‌غیرهدف شود. در هر حال چنانچه پرایمر دایمر بعنوان مانعی مشاهده شوند می‌توان آن را تاحدودی با غلظت حداقل پرایمر و آنزیم كاهش داد.
- در انتهای َ3 پرایمر باید حداقلC یاGقرار گیرد در توالی‌هائی پرایمرهائی كه انتهای َ3 آنها غنی‌ا زG+C می‌باشد احتمال اتصال اشتباهی افزایش می‌یابد
- باید تا حد امكان از توالیهای پالیندرومیك داخل پرایمرها جلوگیری كرد.
- نسبت چهار نوكلئوتید در آغازگر حتی‌المقدور یكسان باشد.
- آغازگر به توالی تكرار شونده ختم نشود.
- دمایTm دو آغازگر نزدیك هم باشد .
- حدمجاز دمای اتصال پرایمر طراحی شده‌باید بین 65-55 باشد. دمای تكثیرایده‌آل 62-72می‌باشد.
درجه حرارتی كه پرایمر بهDNA الگو متصل می‌شود به طول آغازگر و مقدارGC آن بستگی دارد برای پرایمرهای حاوی GC 50% و دارای 20 نوكلئوتید، دمای 55 درجه‌سانتیگراد پیشنهادمی‌شود برای افزایش اختصاصی عمل كردن آغازگر حتی ممكن است دماهای بالاتری هم موردنیازباشد.
برای اینكه هر پرایمر با رشته الگوی خودش هیبرید شود لازم نیست كه عینا و كاملا مكمل رشتهِ الگو باشد برای طراحی پرایمر اغلب از برنامه‌های كامپیوتری ویژه استفاده می‌شود فاصله بین‌پرایمرهایی كه باDNAی هدف هیبرید می‌شود بطور معمول كمتر از 15 كیلو باز می‌باشد.در حقیقت یك كاهش اساسی در سنتز موِثر هنگامی كه محصول تكثیر متجاوز ا زb 1000می‌شود، مشاهده می‌گردد. به همین دلیل طول قطعه مورد تكثیر درPCRنباید بیش ازKb3 باشد وحدمطلوب كمتر ازKb1می‌باشد تكثیر قطعات بسیار طویل و بالایKb 40 مقدور است اما نیاز به روشهای ویژه‌ای دارد.
دمای ذوب آغازگر
دمای اتصال باید بقدر كافی پایین باشد تا پرایمر وDNA الگو قادر به اتصال باشند و از سوی دیگر باید به قدر مناسب بالا باشد تا از تشكیل اتصالات غیراختصاصی جلوگیری كند. دمای اتصال‌از روی شاخصی به نام درجه حرارت ذوب محاسبه می‌شود. دمای ذوب درجه حرارتی است كه درآن نیمی از DNAبه صورت تك رشته‌ای درآمده است. یكی از مهمترین مشخصاتTm وابستگی آن به تركیب بازیDNA استG. وC سه پیوند هیدروژنی و بازهای آدنین و تیمین دوپیوند هیدروژنی دارند. بنابراین هر چقدر مقدار گوانین و سیتوزین درDNAبیشتر باشدTmبیشتراست. دمای 2-1 درجه سانتیگراد كمتر ازTmكافیست كه هیبریداسیون بین پرایمر وDNAی الگودر آن صورت گیرد. دمای ذوب بطور معمول از طریق فرمول سادهِ زیر نیز محاسبه می‌شود.
c 0Tm = ]4 * (G + C) + 2 * (A + T) برای هر پرایمر 20 نوكلئوتیدی
دو پرایمر باید طوری طراحی شوند كه دارایTm یكسان باشند در غیر اینصورت درحرارت مناسب برای یك پرایمر برای جفت دیگر نامناسب خواهد بود.بسیاری از آزمایشگاهها دمای چسبیدن را از 5-3 درجه سانتیگراد زیر دمای ذوب(Tm) كه طریق این فرمول محاسبه شدهاست درنظر می‌گیرند. از این موضوع نتیجه گرفته می‌شود كه‌پرایمرهای با طول زیاد باعث افزایش بالا رفتن اختصاصی بودن واكنش نمی‌شود.
بعضی از محققین رابطه زیر را برای محاسبهTm پرایمر بكار می‌برند.
(FA) 36/0/L) - 005(G + C) - ( 114/0 ]j+[ + 01Log)6/61 + 5/18Tm =
Kcl غلظت كاتیون منو و لنتj=
طول الیگو نوكلئوتیدL=
فرمامید كه یك افزایندهِPCRاستFA =
بطور معمولPCR در غیاب فرمامید انجام می‌شود بنابراین می‌توان آن را از آخر فرمول حذف كرد. این فرمول برای پرایمرهای 07-41 بازی مناسب است.فرمول دیگر برای محاسبهTm پرایمر برای نوكلئوتیدهایbp 20-35 مناسب می‌باشدبصورت زیر است.
(Ln) 64/1 + 22Tp =
كه در آن( G + C ) + ( A + T ) = Ln 2 طول پرایمر وTPدمای مناسب اتصال اس
غلظت پرایمرها و روش اندازه‌گیری آن
غلظت پرایمر بین 50/0 تا 5/0 میكرومول و حد مطلوب 6/0 - 1/0 برای یك واكنش25 میكرولیتری می‌باشد. غلظت بالای پرایمر باعث بسط غیراختصاصی و پرایمر- دایمر می‌شود.بعضی از منابع روش زیر را برای محاسبه غلظت پرایمر پیشنهاد كرده‌اند‌‌‌‌برای انجام این محاسبه ابتدا لازمست كه ضریب تكثیر مولی پرایمر در 260 نانومتر محاسبه شود كه غلظت مولی می‌تواند با استفاده از فرمول زیر محاسبه شود.روش دیگر محاسبه براساسOD 4می‌باشد.
اتصال پرایمر
دما و مدت زمان لازم برای اتصال پرایمر به: 1) طول پرایمر، 2) تركیب نوكلئوتید3) غلظت پرایمر بستگی دارد.با توجه به طیف فعالیت آنزیمTaq پلیمراز كه در محدوده 58-02 درجه سانتیگراد می‌باشددمای اتصال در محدودهِ 72-55 درجه سانتیگراد بطور معمول بهترین نتیجه را می‌دهد افزایش‌دمای اتصال بسط غیراختصاصی را در انتهای َ3 پرایمر كاهش می‌دهد. دمای پایین تكثیر همراه باغلظت اختصاصی بودن واكنش را كاهش می‌دهد
بسط پرایمر
مدت زمان بسط بستگی به عوامل: 1) طول توالی هدف، 2) غلظت توالی هدف و 3) دمای تكثیر دارد.بسط پرایمر بطورمعمول دردمای 72 درجه سانتیگراد انجام می‌شود یك زمان بسط دقیقه‌ای در 72 درجه سانتیگراد برای فرآورده‌های معادل 2 كیلو باز كافیست
بافرPCR
متداولترین بافرPCRكه همراه با تك پلی مراز استفاده می‌شود حاوی غلظت 10 برابركه قبل از استفاده باید به نسبت (10:1) رقیق شود این بافر حاوی اجزای زیر است.
برای یك واكنشPCR ، غلظتTris - Cl ،mM 05-01 می‌باشد KClبا غلظت در حدmM05را می‌توان در مخلوط واكنش بمنظور آسان شدن اتصال پرایمر به رشته الگو اضافه كردNaCl با غلظتmM 05 یاKCl با غلظت بیش ازmM 50 اثر باز دارندگی بر روی فعالیت آنزیم تك پلی مرازدارند.
غلظت منیزیم
غلظت منیزیم در تكثیر اختصاصی و نیز فعالیت آنزیمTaq پلی مراز موِثر استPCR . بایستی دارای 5/0 تا 5/2 میلی مول منیزیم باشد حضورEDTAدر مقدار منیزیم اشكال ایجادمی‌كند غلظتMgCl2 در مخلوط نهائی واكنش می‌تواند متغیر باشد معمولاإ میزان بهینه آن درمحدودهِ 5-5/0 میلی مول است.یون +2Mgدو عمل انجام می‌دهد: اول اینكه باdNTPیك تركیب قابل حل ایجاد می‌كنند،دوم فعالیتTaq پلی مراز را تحریك می‌كند معمولا كمبود +2Mg باعث كاهش بازده و زیادی آن باعث تكثیر غیراختصاصی می‌شود.
آنجائی كهdNTP می‌تواند به +2Mgبچسبد، تعیین دقیق غلظت منیزیم به غلظتdNTPبستگی‌دارد در غلظت مناسب منیزیم و افزایشmM 6-4dNTP ،سرعت سنتز تك پلی مراز 30-20 درصدكاهش می‌یابد.
دی‌اكسی نوكلئوزیدتری فسفاتهاdNTP))
dNTP به دو صورت منفرد یا مخلوطی از چهارdNTPتهیه می‌شودpH . اكثر محلولهایاستوك باNaOHبه 5/7 رسانده می‌شود.PCRمعمولا با غلظت حدود میلی‌مول،dNTP100 انجام میگیرد اما غلظت مناسبdNTP بستگی به غلظتMgCl2، غلظت پرایمر، طول محصول تكثیر شده و تعداد سیكلهایPCRدارند. محلولهای پایهdNTPدر 20- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود. و این محلولهای پایهdNTP باید تا 7pH=خنثی شود و از طریق اسپكتوفتومتر تعیین غلظت شوند.در كارهای مولكولی توصیه می‌شود كه در محلول كار، از هرdNTPیك میلی مول موجودباشد برای به حداقل رساندن خطاها هرنوعdNTP باید درغلظت‌های مساوی بكاربرده شوند یعنی از علل بسط غیراختصاصی غلظت كمتر از یك میكرومولdNTP یا غلظت كم یكی از بازها است‌‌‌‌تركیب دمای بالا بسط و اتصال بالای 55 درجه و غلظت پایین 50-10 میكرومولdNTP باشد.باعث بیشترین دقت در فرآوردهِ نهاییPCR می‌شود
آنزیمهای پلیمراز
DNA پلی مرازها آنزیمهائی هستند كه با استفاده از منومرهای دی‌اكسی نوكلئوزیدتری فسفات و با الگو قرار دادن رشته اصلی ساخت زنجیره پلی نوكلئوتیدی را تسریع می‌كنند. ساختDNA معمولا از جهت َ5 بطرف َ3 است، زیرا پلیمریزاسیون اغلب از 5 آلفا فسفات دزكسی‌نوكلئوتید تری‌فسفات بطرف پایانهِ 3 گروه هیدروكسیل رشتهDNA استDNA . پلی مراز برخلافRNA پلیمراز نیاز به قطعهDNA كوچك یا پرایمر برای چسبیدن به توالی مكمل دارد DNA پلی مرازها قادر به تكثیر قطعاتی با حداكثر 004 جفت باز می‌باشند و در دماهای بالاعلت حساس بودن این آنزیم نسبت به دما باید مرتباإ پلیمراز جدیدی اضافه شود. این نحوه عمل‌سرعت و دقت عمل را پایین می‌آورد.
DNA پلیمراز تگ
حسن این نوعDNA پلی مراز درجه حرارت بالا (59-09 درجه سانتیگراد) آن است. علاوه بر این آنزیم تك می‌تواند قطعاتDNA به طول 10 هزار جفت را تكثیر كند.استفاده ازDNA پلیمراز مقاوم به حرارت حاصل از باكتری ترموس آكواتیكوس كه منشاءچشمه آب گرم پارك ملی یلواستون می‌باشد باعث ساده و خودكار شدن واكنش می‌شود. پلی‌مرازهای مقاوم در برابر حرارت موجب شده‌اند كه بسط اختصاصی فرآوردهPCR بخاطر اتصال وبسط آغازگر در دمای بالا افزایش یابد.دمای مناسب برای فعالیت این آنزیم با توجه به الگویDNA ، برابر 80-75 درجه سانتیگراداست. در دمای 07 درجه سانتیگراد بیش از 65 نوكلئوتید در ثانیه پلی مریزه می‌شود.
غلظت آنزیم
غلظت توصیه شده برای تگ پلیمراز بین 5/2-1 واحد در صد میكرو لیتر واكنش توصیه شده است. در صورتیكه غلظت آنزیم بسیار بالا باشد، فرآورده‌های زمینه‌ای غیراختصاصی افزایش‌می‌یابد و پایین بودن بیش از حد غلظت نیز باعث كم شدن فرآورده‌های مورد نظر می‌شود. برای‌تكثیرDNAژنومی یك غلظت بهینه ازTaq معمولا حدود 4-1 واحد درصد میكرو لیتر واكنش‌توصیه می‌شود.
اختصاصی بودن واكنش
آنزیم مناسب و كنترل عواملی از جمله غلظت آنزیم، غلظت قطعات آغازگر، همانندسازی‌درجه حرارت دقیق و زمان نگهداری محیط عمل در یك درجه حرارت معین و تعداد چرخه در هرآزمایش همه در اختصاصی بودن واكنش اثر می‌گذارند.بطور كلی عواملی كه در كارآییPCR ایفای نقش می‌كنند عبارتند از:
غلظتMgCl2 ، كیفیت و كمیتDNA الگو، بافرPCR، غلظتdNTP، افزاینده‌هایPCR،بازدارنده‌هایPCR ،Nested PCR،PCR با شروع داغ، تعداد سیكلPCR و دمای اتصال‌پرایمر
مهار كننده‌ها و افزایش دهنده‌هایPCR
مواد لیست شده در جدول ذیل می‌توانند درPCR حاوی نقش باشند.ژلاتین یا آلبومین سرم100 نانوگرم در 50 میكروگرم واكنش‌‌‌فرمامید5%، دی‌متیل سولفوكساید(DMSO) 01-2%پیروفسفاتاز‌‌واكنش‌واحد 100/0 – 01،تترامتیل آمونیوم كلراید(TMAC) 001-01 میكرومول پلی‌اتیلن گلایكول 000651-5 درصد،گلیسرول5-1 درصد،توین 025/2-1 درصد،پروتئین ژن 232 نانومول،7 دی‌اَز - َ2dGTP-با 57% جایگزین،پروتئین تك رشتهDNA 1واحد،كلی‌باسیل 1 واحد، بتائین5 میكروگرم در میلی‌لیتر، ژلاتین یا آلبومن سرم حیوانی به غلظت 100 میكروگرم بر میلی لیتر و شوینده غیریونی مانندتوین 02 یا Laurth-21 (1/0 تا 50/0) درصد برای ثبوت پایداری آنزیم اضافه می‌شود.DMSO ساختمان ثانویهDNA هدف را كاهش می‌دهد. آزمایشات نشان داد. بطور سطحی اثر بازدارندگی بر رویTaq داشته و باعث كاهش بازده كل شده است. شوینده‌های‌غیریونی نظیرTritonX100 و توین20 تا غلظت 5% مهار كننده نیست شوینده‌های یونی مانندسدیم دودسیل سولفات(SDS) فقط در غلظتهای بسیار پایین قابل تحمل است و این شوینده باروش استخراج فنل و رسوب اتانل قبل ازPCR ازDNA حذف می‌شود.SDS در غلظت 2-1 درصد استفاده می‌شود در حالیكهTaq پلیمراز در غلظتهای بالاتر. 1ر0درصدSDS مهار می‌شود.Taq پلیمراز به عمل هضمی پروتیئنازK حساس است، بنابراین پروتیئنازK بایستی حذف یا غیرفعال شود. دمای 59 درجه سانتیگراد برای رسیدن به چنین هدفی كفایت می‌كند. تیمار كردن‌حرارتی و سپس استخراج بوسیلهِ فنل پروتیئنازK را واسرشت می‌كند. آثار باقیماندهِ فنل می‌تواندباعث مهارPCR شود كه توسط كلروفورم حذف می‌شود.
شروع داغ
چنانچه لازم باشد تعداد زیادی نمونهِPCR آماده گردد. ایجاد شرایط یكنواخت و مساوی برای هر تیوپ مشكل است علاوه بر این باز و بسته كردن تیوپ برای انجام نمونه برداری‌های‌مختلف باعث می‌شود كه خطر آلودگی بالا رود. بنابراین اجزای واكنش را بطور فیزیكی با ماده‌ای كه‌بعنوان مانع بكار برده می‌شود می‌توان جدا كرد. هنگامیكه این ماده در حین بالا رفتن دما ذوب‌می‌شود آن ماده عاملی برای مخلوط شدن تمام اجزای واكنش بطور همزمان در زمان شروعPCR می‌باشد
به عنوان مثال در این تكنیك اجزای تركیب شوندهPCR به جزDNAپلیمراز و الگویDNAبا همدیگر مخلوط می‌شوند. سپس یك عدد آمپلی واكس به مخلوط اضافه می‌شود كه در80-75 درجه به مدت 10-5 دقیقه ذوب می‌شوند سپس اجازه داده می‌شود كه قطعه مومی خنك‌و به حالت جامد درآید و اجزای باقیمانده واكنش كه شاملDNA پلیمراز و الگویDNA و بافرمی‌باشد بر روی قطعه مومی اضافه و تیوپها در ترموسایكلر قرار داده می‌شوند. اگر ما موم را ذوب‌كنیم، اجزایPCR به همدیگر مخلوط می‌شود و موم به سمت بالا و در سطح مایع قرار میگیرد.پس از اتمامPCR تیوپها در دمای زیر 35 درجه خنك می‌شوند و موم به حالت جامد در می‌آید.
PCR آشیانه‌ای
PCR آشیانه‌ای یكی از راههای افزایش دقتPCR می‌باشد. در این روش از دو نوع پرایمر استفاده می‌شود. ابتدا پرایمر اول اضافه می‌شود و باعث تكثیر قطعاتی ازDNAمی‌شود كه احتمال‌دارد به میزان دلخواه اختصاصی نباشد سپس پرایمر دوم اضافه می‌شود كه خصوصیات آن تكثیرقسمت داخلی‌تر یا بعبارت دیگر اختصاصی‌تر می‌باشد.در واقع جفت پرایمر دوم پرایمرهائی هستند كه داخل جفت اولیه هستند و قطعات طویلتربوسیله اولین دورP CRتولید می‌شوند به عنوان یك الگو برایPCR دوم بكار می‌روند.
اثر فلات
كاهش سودمندی تكثیر و رسیدن به یك سطح ثابت تكثیر در نتیجه كاهش مقدار آنزیم‌سیكل‌های بعدی را در اصط‌لاح اثر فلات در واكنش تكثیری گویند. این فلات درPCR باTaq خیلی‌دیرتر از واكنش كه با آنزیم كلنو انجام می‌شود تشكیل می‌شود و بطوركلی اختصاصی بودن واكنش راافزایش می‌دهد.
آلودگیهایPCR
در عملPCR باید از تكثیر آلوده‌كننده‌هایی مانندDNA های تكثیر شده در آزمایشهای قبل جلوگیری به عمل آید. منابع زیادی برای آلودگیPCR وجود دارد كه در جدول زیر آمده است
منابع بالقوه آلودگیPCR
هود و تهیه فیلترها، دستگاه الكتروفوژ، لوله‌های سانتریفوژ، وارد كردن نوك پپیت به ژل،ترموسایكلر، بلوك‌های حرارتی، روشهای جمع‌آوری نمونه، آب یا سیستم خنك كننده، محیط آزمایشگاه، پرسنل آزمایشگاه، دستگاه هموژنیزه كننده بافت
منابع بالقوه آلودگی
برای جلوگیری از آلودگیPCR آزمایشات باید در هود ویژه یا حداقل قسمتی از آزمایشگاه صرفا به اینكار اختصاص داده شده قرار گیرد. تجهیزات و محلولهائی كه مرتب درPCR كاربرد داردباید تحت نگهداری ویژه باشد‌‌‌‌هر ماده كه قابل اتوكلاو كردن است باید استریل شود و از دستكش در تمام مراحلPCR استفاده كرد و همچنین عینك و روپوش آزمایشگاهی نیز لازم است. محلولهائی مانند بافر وdNTP باید در سیستمهای بسته نگهداری شود و برای جلوگیری از آلودگی محلول پایه را باید به چندقسمت تقسیم نمود. در ذیل بعضی از روشها كه مانع آلودگی می‌شود ذكر شده است
- اوراسیل - ان - گلیلوسیلاز (این آنزیم محصولات قبلیPCR را از بین می‌برد
- اشعه ماوراء بنفش
- تیمار آنزیمی
- مدت زمان واسرشت شدن
- درجه حرارت واسرشت شدن
- تعداد چرخه
- استفاده ازdUTP به جایdTTP ،
روغنهای معدنی
روغنهای معدنی سبك برای پوشاندن مخلوطPCR و جلوگیری از تبخیر به كار می‌روند بطوركلی حدود 60-40 میكرولیتر از روغن به 100 میكرولیتر از محلولPCR اضافه می‌شود روغن‌همچنین از آلودگی نمونه‌ها جلوگیری می‌كند چنانكه سرپوش ترموسایكلر گرم شود احتیاجی به‌پوشش با روغن نمی‌باشد روغن را با پیپت یا استخراج با كلروفورم براحتی می‌توان خارج ساخت.
منبع : سایت نوآوری
تبادل
لینک هوشمند